皮膚致敏限定方法-化學品安全性評估的新“裏程碑”

毒理評估
2021年12月22日

隨著毒理學學科的延伸與發展,越來越多的研究工具和評估方法被開發出來,以替代傳統的動物試驗,一方麵能更好地保障動物福利,另一方麵也可以實現更高通量的評估效率。這些替代方法包括了化學測試(in chemico)、體外測試(in vitro)和計算機模擬(in silico),並可應用於皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等毒性節點方麵。但是在不少替代方法的實際使用過程中,受限於單個方法本身的局限性,通常需要采用多組替代方法並結合專家評價的方式得出最終的結論以用於法規需求。為了提高替代方法在化學品法規應用方麵的適用性與規範性,經濟合作與發展組織(OECD)於2021年7月首次發布了一類限定方法(Defined Approach, DA)來用於評價化學品的皮膚致敏性。該方法被采納為OECD TG 497,主要基於皮膚致敏的有害結局(Adverse Outcome Pathway, AOP)框架,通過限定的幾組替代方法采用規範化流程來完成對目標化合物評估致敏性的評價。

有害結局路徑(AOP)與皮膚致敏作用機製

有害結局路徑(Adverse Outcome Pathway, AOP)最核心的內容在於規範化和模塊化了從分子、細胞、組織、器官及至最終個體與群體水平的一係列毒性發生事件,並強調以邏輯推理性來確定這些毒性發生事件的前後關係。在AOP框架中,毒性事件可以具體分為分子起始事件(Molecular Initiating Event, MIE; 在OECD指南中也被定義為Key Event 1, KE1),關鍵事件(Key Events, KEs)和有害結局(Adverse Outcome, AO)這三大類,而各個過程則是通過關鍵事件關係(Key Event Relationships, KERs)進行連接。簡單地來說,皮膚致敏事件可以理解為由一個分子起始事件開始,從而導致多個關鍵事件的發生,最後終結於“過敏性接觸性皮炎”這一有害效應的過程。

有關於AOP的詳細介紹可以查看瑞歐之前發布過的專家文章:有害結局路徑(AOP):從毒性作用機製出發的化學品風險管理策略 以歐盟植物保護產品內分泌幹擾評估為例

皮膚致敏限定方法的開發即是建立於皮膚致敏的AOP框架之中(AOP ID: 40; OECD Project: 1.1),皮膚致敏過程分為誘導階段和隨後的免疫反應激發階段。第一個階段主要的分子起始事件(MIE, 即KE1)為外源物質與皮膚蛋白的共價結合,形成半抗原。隨後觸發了兩個細胞水平的關鍵事件(KEs),其中KE2為角質細胞炎症反應;KE3則是樹突狀細胞的激活。第三個關鍵事件(KE4)則發生在器官水平,其過程為KE3中經活化的樹突狀細胞遷移至局部淋巴結,並向初始型T細胞遞呈組織相容性複合物(MHC),從而導致記憶T細胞的增殖與分化。而一旦此個體的皮膚再次接觸原外源化合物時,則會進入免疫反應激發階段,最終造成有害結局(AO):過敏性接觸性皮炎的發生。

皮膚致敏的AOP框架

 

皮膚致敏過程的誘導階段 

皮膚致敏過程的激發階段

與關鍵事件(KE)相關的皮膚致敏試驗方法

基於已建立的皮膚致敏的AOP框架,截止到目前針對於KEs已經有開發了一係列測試方法,且部分已被OECD測試指南收錄為標準方法。針對這部分被OECD測試指南收錄的方法總結如下:

皮膚致敏的體外測試方法

MIE, 即KE1

  • 外源物質與皮膚蛋白的共價結合,形成半抗原

1. 直接多肽反應試驗(DPRA),2015被采納為OECD TG 442C

2. 氨基酸衍生物反應試驗(ADRA),2019年增補為OECD TG 442C

KE2

  • 角質細胞炎症反應

  • 角質細胞抗氧化響應元件的基因表達

1. 基於抗氧化響應元件(ARE)-轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)的熒光素酶檢測方法,其中ARE來自人源AKR1C2基因(KeratinoSensTM),2015年被采納為OECD TG 442D

2. 基於抗氧化響應元件(ARE)-轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)的熒光素酶檢測方法,其中ARE來自大鼠NQO1基因(LuSens),2018年被增補為OECD TG 442D

KE3

  • 樹突狀細胞的激活

1. 檢測人體單核白血病細胞係THP-1細胞中CD86和CD54的表達(h-CLAT),2016年被采納為OECD TG 442E

2. 骨髓U937皮膚致敏試驗(U-SensTM),2018年增補為OECD TG 442E

3. 白細胞介素-8報告基因試驗(IL-8 Luc),2018年增補為OECD TG 442E

皮膚致敏的體內測試方法

KE4

  • T細胞增殖

1. 皮膚致敏:局部淋巴結試驗(LLNA,放射性檢測法),OECD TG 429

2. 皮膚致敏:局部淋巴結試驗(DA法),OECD TG 442A

3. 皮膚致敏:局部淋巴結試驗(BrdU-ELISA法),OECD TG 442B

AO

  • 再次接觸原外源化合物時,進入免疫反應激發階段,最終造成過敏性接觸性皮炎的發生

1. 皮膚致敏試驗(Buehler試驗(BT)/豚鼠最大化試驗(GPMT)),OECD TG 406

限定方法(DA)與整合測試和評估方法(IATA)的比較

雖然基於皮膚致敏AOP框架已開發了上述一係列的體外測試方法,但由於皮膚致敏反應機製涉及多因素、多水平的複雜分子生物學過程,因此單一的體外測試方法並不能保障對目標化合物的皮膚致敏性有足夠的預測能力。基於這一原因,皮膚致敏整合測試和評估方法(integrated approach to testing and assessment, IATA)應運而生。具體而言,IATA運用了多組體外測試結果並結合了專家評價來綜合判斷目標化合物是否具有皮膚致敏性,但顯而易見的是這種方式並不能完全適用於法規需求中的決策目的,最主要的影響條件在於不同專家評價結果可能會導致開放性的結論,造成無法對目標化合物的皮膚致敏性評估達成統一性判斷。

為了讓替代方法更能夠滿足法規需要,逐漸發展而來的限定方法(Defined Approach, DA)與IATA最大的差異在於不再依賴專家評價,僅采用限定的幾組體外試驗結果,即可對目標化合物完成致敏性評估。除此之外,通過按規定流程結合(Q)SAR預測的方式,DA也能夠進一步得出法規所需的統一危害分類結果。

皮膚致敏限定方法OECD TG 497的評估流程

在OECD TG 497中,皮膚致敏性的限定方法主要有如下3種:

  • 從一組in chemico 試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)和兩組in vitro 試驗(KE2, OECD TG 442D: KeratinoSensTM; KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)中采用“3選2(2o31)”的限定方法對目標化合物的皮膚致敏性進行危害識別。

  • 通過采用一組in chemico試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)、一組in vitro試驗(KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)與一組in silico方法(Derek Nexus)的結果形成整合測試策略(ITSv12),基於EG DASS3專家組發展而來的數據解釋步驟(DIP4)來對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類結論。

  • 通過采用一組in chemico試驗(KE1, OECD TG 442C: DPRA)、一組in vitro試驗(KE3, OECD TG 442E: h-CLAT)與一組in silico方法(OECD QSAR Toolbox)的結果形成整合測試策略(ITSv22),基於EG DASS3專家組發展而來的數據解釋步驟(DIP4)來對目標化合物的皮膚致敏性得出UN GHS危害分類結論

  1. 2o3: 3選2(2 out of 3)

  2. ITSv1或ITSv2: 整合測試策略v1或v2(integrated testing strategy version 1 or version 2)

  3. EG DASS: 皮膚致敏限定方法開發專家組(Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation)

  4. DIP: 數據解釋步驟(Data interpretation procedure)

2o3皮膚致敏限定方法的決策樹

ITSv1/ITSv2皮膚致敏限定方法的決策樹

皮膚致敏限定方法的性能評估

雖然受限於數據集的大小,但在OECD TG 497中也盡可能地評估了三種限定方法對皮膚致敏的預測性能(如下圖所示)。可以發現的是當前這三種限定方法已在準確度(Balanced Accuracy, BA)、靈敏度(Sensitivity, Sens)和特異性(Specificity, Spec)方麵均基本能滿足法規需求,且與IATA相比也不再需要額外的專家評價,因此該限定方法的開發極大提升了替代方法應用於皮膚致敏評估時的適用性與規範性。

但仍需要注意的是這些限定方法仍受限於具體的替代方法本身(如DPRA, KeratinoSensTM和h-CLAT對於Log P > 3.5的目標化合物預測靈敏度較低;金屬化合物不適用於DPRA試驗等),以及當出現不明確的結論時還需要進一步的分析策略。

三種限定方法與LLNA方法在預測OECD標準物質致敏性的表現

隨著替代方法成為化學品安全性評價中發展的新趨勢,瑞歐科技也立足技術演進,積極布局替代方法在化學品、化妝品、農藥、藥品等方麵的應用,綜合運用計算化學、(Q)SAR、體外試驗等解決皮膚致敏、皮膚刺激/腐蝕、基因毒性等評估中所麵對的實際問題。

對於非測試方法,瑞歐科技可為客戶提供多達十幾種(Q)SAR軟件預測與專家評估服務。同時,為了進一步提高預測結果的有效性和可靠性,瑞歐科技也於近期與全球知名的信息平台Lhasa開展正式合作,將領先的(Q)SAR預測係統Derek Nexus & Sarah Nexus納入為客戶提供服務的軟件工具中。在限定方法OECD TG 497中,整合測試策略(ITSv1)的in silico方法使用的即是Derek Nexus v6.1.0。在2020年約翰霍普金斯動物試驗替代中心主導開展的一項針對皮膚致敏性節點的計算機模擬方法評估的研究中,Derek Nexus在Basketter數據集和HSDB數據集中均表現出了良好的適用性和準確度。瑞歐科技希望,通過與商業軟件平台開展更全麵的合作,能夠向客戶提供更高質量的毒理學節點的評估服務,同時也參與到替代方法在化學品、化妝品、農藥、藥品等行業的深入推廣中去。


Derek Nexus介紹 - 規則模型(Rule-based models)

Derek Nexus是歐盟農藥等同性評估和其他(如巴西)國家農藥監管機構推薦使用的(Q)SAR軟件預測係統,也被醫藥監管機構FDA、EMA和NMPA所廣泛采用。

特點

  • 基於毒理學專家數十年的經驗積累

  • 涵蓋數百種結構警報,並對難預測的毒性結構如芳香胺等充分優化

  • 廣泛的毒理學節點:基因毒性、皮膚致敏性、致癌性、生殖/發育毒性、神經毒性等

  • 高度透明,所有毒理學評估依據、文獻來源均可獲取

Sarah Nexus介紹 - 統計模型(statistic-based models)

Sarah Nexus基於一種新穎的層次聚類模型SOHN方法來自學習訓練集中的碎片化分子結構,通過這種機器學習方法從而靈敏的識別目標分子中與基因毒性相關的結構特征。

特點

  • 高靈敏度的預測方法,與Derek Nexus配合使用能極大提高預測的有效性與可靠性

  • 基於可靠、海量的Ames致突變試驗數據

  • 訓練集通過了充分的可靠性驗證,能夠提供可信的數據來源

  • 高度透明,具有完備的推理過程


參考文獻

[1] 程樹軍, 王慧. 預測毒理學與替代方法. 2020.

[2] OECD. Guideline No. 497: Guideline on Defined Approaches for Skin Sensitisation. 2021.

[3] OECD. The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Protein, Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment, No. 168. 2012.

[4] OECD. The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Protein, Part 2: Use of the AOP to Develop Chemical Categories and Integrated Assessment and Testing Approaches. Series on Testing and Assessment, No. 168. 2012.

[5] Golden, E., Macmillan, D. S., Dameron, G., Kern, P., Hartung, T. and Maertens, A. (2021) “Evaluation of the global performance of eight in silico skin sensitization models using human data”, ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 38(1), pp. 33-48. doi: 10.14573/altex.1911261

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